1、 標本的固定：不當?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。查看一抗說明書或相關(guān)文獻，使用推薦的固定液（如10%中性緩沖福爾馬林固定液等）。

2、抗原的修復(fù)方式：煮沸修復(fù)和高壓修復(fù)是國際公認的較好的修復(fù)方式，但具體使用那種修復(fù)方式應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果或廠家說明書進行選擇。

3、抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出最佳的使用濃度。通常，如果背景染色很少或沒有，可適當延長孵育時間。

4、切片上遺留了過多的沖洗液，當抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。

5、 孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。

1、抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色，這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。

2、一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。

3、內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。

4、非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

5、DAB孵育時間過長或濃度過高，可通過降低DAB濃度或者縮短孵育時間來降低背景染色。

6、PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤為重要。

7、標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色，確保實驗過程中保證切片的濕潤。

8、抗體稀釋液的pH值偏低和封閉血清的失效。