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MLH1說明書

說明書編號：MyM1-MLH1253

（本抗體僅供研究使用，不用于臨床診斷）

【產(chǎn)品名稱】

【產(chǎn)品編號及包裝規(guī)格】

【預(yù)期用途】

本抗體試劑適用于福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織切片的免疫組織化學(xué)染色，用于標識MutL蛋白同系物1蛋白在組織中的表達。

MLH1(MutL protein homolog 1)是一種錯配修復(fù)蛋白，其基因定位在3號染色體P臂的21.3位上。突變型的錯配修復(fù)蛋白常表達于高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）患者中，與常染色體的顯性遺傳相關(guān)，也稱為遺傳性非息肉病性結(jié)、直腸癌(HNPCC)，也可見于散發(fā)性（MSI-H）結(jié)、直腸癌患者。MLH1、MSH2、MSH6抗體可用于患者及其家族對該疾病的篩查研究。文獻報道高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）的結(jié)、直腸癌患者比低頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-L）及微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）的患者的預(yù)后好。

（注：對免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進行，本染色結(jié)果不作為診斷指標。）

【主要組成成分】

單克隆鼠抗人MLH1蛋白抗體，克隆號：MyM1-MLH1，免疫球蛋白分型：IgG。本產(chǎn)品為組織培養(yǎng)上清，含有0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.015 mol/L疊氮鈉（N_aN₃）及蛋白穩(wěn)定劑。

【儲存條件及有效期】

試劑需在2-8℃(不可低于0℃)避光保存。每次使用后應(yīng)立即放回2-8℃冰箱保存。有效期見產(chǎn)品外包裝。（注：如果試劑未按上述條件儲存, 可能影響其使用效果）。

【免疫組化染色原理】

在免疫學(xué)中，抗原抗體分子由于結(jié)構(gòu)的互補和彼此親和性會發(fā)生特異性結(jié)合，基于此原理，抗體將會與待測人體組織及細胞中特異的抗原/蛋白結(jié)合。隨后通過氧化還原化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的酶顯色劑顯色，從而顯示組織及細胞內(nèi)的抗原分布。

首先，本抗體與待測組織上的抗原特異性結(jié)合；其次，酶標抗小鼠/兔IgG聚合物識別已經(jīng)連接上抗原的抗體；再次，加入顯色底物，聚合物上的辣根過氧化物酶可以催化DAB顯色液中的H₂O₂分解，使聯(lián)苯胺氧化變成聯(lián)苯亞胺，從而使組織切片中抗原位點處出現(xiàn)黃色或棕黃色著色；最后對樣本進行復(fù)染和封片。通過顯微鏡觀測顯色情況，推斷組織切片上該抗原的存在位置和表達情況。

【樣本要求】

新鮮活檢或手術(shù)樣本組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定6-24小時，按技術(shù)規(guī)范要求進行取材、脫水、石蠟包埋制成蠟塊。蠟塊在常溫條件下保存有效期5年。

對標本蠟塊進行切片，厚度3-5μm，粘附在經(jīng)防脫處理的載玻片上，在58-60℃恒溫箱中烤片1小時，以備染色。暫不使用的白片在室溫（15-25℃）下保存（最好防氧化處理），為了良好地重現(xiàn)組織切片中的抗原分布情況，建議在7日內(nèi)完成免疫組化染色。

【染色方法】

以下為針對手工免疫組化法推薦的配置及步驟，如果采用自動化免疫組化儀器進行染色，請根據(jù)不同的儀器及顯色試劑盒進行調(diào)整。一次完整的免疫組化實驗應(yīng)設(shè)立陽性組織對照、陰性組織對照以及空白(或陰性)試劑對照，對實驗結(jié)果的評估及驗證請參照【質(zhì)量控制】和【染色結(jié)果的解釋】。

1） 所需儀器、設(shè)備：

電磁爐、不銹鋼鍋、計時器、孵育濕盒、染色架、染色缸、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡（40×-200×）、洗瓶、抽紙、移液器等。

2） 試劑、材料準備：

本抗體試劑工作液使用前無需稀釋,如為濃縮液，使用前推薦用PBS緩沖液或抗體稀釋液按1:100-1:200稀釋成工作液。PBS緩沖液、抗原修復(fù)液、二抗以及DAB顯色液等試劑的配制請參見各產(chǎn)品說明書。

實驗所需的其他材料如下所示：

PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、HRP酶標記的抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色液、蘇木素染色液、空白(或陰性)對照試劑、陽性及陰性對照組織切片、二甲苯或二甲苯替代品、乙醇（無水、 95%、 85%）、蒸餾水或去離子水、封片劑（如中性樹膠）、防脫載玻片、蓋玻片等。

3） 實驗溫度條件：室溫18℃-28℃。

4） 實驗步驟：

A、脫蠟和水化

（1）將組織切片依次置于2缸新鮮二甲苯中，各浸泡10分鐘；

（2）將組織切片依次置于無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中，各浸泡5分鐘；

（3）蒸餾水輕柔沖洗1分鐘，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備修復(fù)。

B、抗原修復(fù)（高壓修復(fù)）

（1）取配制好的Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）于高壓鍋中，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入修復(fù)液中，確保組織切片完全浸入修復(fù)液；

（2）蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，大火（1600W/210℃）加熱至噴氣，從噴氣開始計時2分鐘并調(diào)至中火（800W/130℃），計時結(jié)束后，關(guān)閉電磁爐，將高壓鍋平穩(wěn)移離熱源，自然冷卻5分鐘；

（3）將高壓鍋平穩(wěn)轉(zhuǎn)移至水槽中，打開流水澆至鍋蓋，使鍋蓋降溫，直至自動鎖芯落到原位，關(guān)閉流水，取下限壓閥，小心打開鍋蓋（注意蒸汽燙傷），再向鍋內(nèi)緩慢注入流水（避免流水直接沖向組織切片）；

（4）待溫度降至40℃以下時（水溫不燙手），取出切片架并快速浸入蒸餾水中（避免干片），用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備阻斷。

（注：修復(fù)后組織切片易干片，后續(xù)操作中“甩去組織切片多余液體”皆需注意不能讓組織干片，否則會影響染色效果。）

C、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

（1）甩去組織切片多余液體，將玻片快速置于過氧化物酶阻斷劑（3% H₂O₂）中浸泡10分鐘；

（2）阻斷結(jié)束，用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備畫圈。

D、畫圈

甩去或小心拭去組織切片周圍多余液體，用免疫組化油筆圍繞組織畫圈，畫圈位置應(yīng)距組織邊緣2~3mm處，確保整個圈包圍全部組織后用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗掉多余油液后浸泡在PBS緩沖液中準備一抗孵育。

E、滴加一抗或?qū)φ赵噭?/span>

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫的圈完全顯現(xiàn)后滴加一抗工作液使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育60分鐘；

（2）一抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

（注：實驗過程中，使用PBS緩沖液沖洗組織切片時，勿直接沖洗組織表面，否則可能導(dǎo)致掉片。）

F、滴加HRP酶標記的二抗聚合物

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫的圈完全顯現(xiàn)后滴加一步法二抗試劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育20分鐘；

（2）二抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

G、滴加DAB顯色劑

（1）甩去組織切片多余液體，滴加新鮮配制的DAB顯色劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育5分鐘；

（2）DAB孵育結(jié)束，將玻片上的DAB 震落于紙巾上，再放入蒸餾水中充分沖洗3分鐘×2次，終止染色。

H、復(fù)染、返藍

（1）蒸餾水充分沖洗后，置于蘇木素染色液中復(fù)染8~10秒，復(fù)染后用蒸餾水沖洗干凈；

（2）復(fù)染后，置于1%碳酸鋰溶液中返藍8~15秒，返藍后用蒸餾水沖洗干凈。

（注：依據(jù)不同蘇木素染色液的強度調(diào)整復(fù)染時間，以細胞核呈現(xiàn)淡藍到深藍顏色為宜，過染或不足染色都有可能影響結(jié)果的判斷。）

I、脫水、透明、封片

（1）甩去組織切片多余液體，將組織切片依次置于85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，各浸泡3分鐘；

（2）脫水結(jié)束，將組織切片置于新鮮二甲苯中，浸泡5~10分鐘；

（3）待組織切片呈透亮狀態(tài)后即可使用中性樹膠和蓋玻片封片。

5） 結(jié)果判讀：

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗的專業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對染色后的切片進行觀察并進行判讀。

【質(zhì)量控制】

在開始解讀待檢標本的染色結(jié)果前，應(yīng)該先對試劑對照及組織對照等一系列質(zhì)控的染色結(jié)果進行分析確認，與已知的陽性和陰性結(jié)果對比，并參考既往質(zhì)控的染色結(jié)果。只有一系列對照都顯示了與已知相符的染色結(jié)果，待檢標本的染色結(jié)果才被認為是有效的。一次完整的免疫組化實驗應(yīng)設(shè)立陽性組織對照、陰性組織對照以及空白(或陰性)試劑對照，以確保整個實驗過程是準確可控的。

陽性組織對照應(yīng)該是新鮮的活檢或手術(shù)標本，按照與待檢標本相同的方法進行固定、前處理及石蠟包埋制片的。理想的陽性組織對照應(yīng)該已知含有被測抗原高表達及低表達二種情況，以確保實驗結(jié)果能體現(xiàn)出不同待檢標本中的不同抗原表達水平，尤其可避免漏檢低表達的病例。正常的陽性組織對照染色結(jié)果表明待檢標本組織制備正確，染色方法適當。每次染色實驗均需要設(shè)立陽性組織對照。如果陽性組織對照未能顯示正確的陽性染色，則該次待檢標本的染色結(jié)果應(yīng)該被認為是無效的。（注：陽性組織對照染色結(jié)果正常僅能表明實驗流程及試劑的性能符合要求，并不能作為待檢標本染色結(jié)果特異性的評價標準。）

陰性組織對照也應(yīng)是按照與待檢標本相同的方法進行固定、前處理及石蠟包埋制片的，并且已知其中沒有被測抗原的表達。每次染色實驗均需要設(shè)立陰性組織對照，以確認抗體的性能，并能夠提供特異性染色的背景。大多數(shù)時候待檢標本組織切片內(nèi)會含有不同的細胞類型，那些陰性的細胞可作為內(nèi)部的陰性組織對照。如果陰性組織對照出現(xiàn)了特異性陽性染色，則該次待檢標本的染色結(jié)果應(yīng)該被認為是無效的。

空白(或陰性)試劑對照可選擇用PBS緩沖液或與一抗同源的IgG替代一抗進行實驗，目的是評估一抗的特異性染色，判斷是否存在非特異性著色，并對抗原部位特異性染色提供更好的解釋。空白(或陰性)對照試劑的孵育時間和溫度應(yīng)與一抗一致。

【染色結(jié)果的解釋】

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗的專業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對染色后的切片進行觀察并進行判讀。

A、 免疫組化染色結(jié)果應(yīng)該建立在一系列對照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，否則該次染色結(jié)果應(yīng)該被認為是無效的。

B、 染色結(jié)果陽性（+）：在一系列對照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細胞的特定部位見有棕黃色著色，且無背景染色，表示被測抗原存在表達。

C、 染色結(jié)果陰性（-）：在一系列對照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細胞中未見棕黃色著色，表示被測抗原無表達或表達量極低。

【染色方法的局限性】

1） 標本的固定和前處理、組織的抗原修復(fù)、抗體孵育溫度及時間或其他實驗條件的改變都有可能影響染色結(jié)果的正確性。

2） 在每一次染色過程中，應(yīng)該設(shè)立空白(或陰性)試劑對照、陽性組織對照及陰性組織對照，且所有對照染色結(jié)果都應(yīng)正常，否則該次實驗被認為是無效的。

3） 完整的免疫組化實驗過程有多個步驟，包括試劑的選擇，組織的選擇，固定和處理，切片的準備，染色及結(jié)果解釋。染色前組織的處理方式能直接影響染色效果。不恰當?shù)墓潭?、冰凍、熔化、清洗、烘干、切片或被其他組織或液體污染都可能造成假陽性，抗體定位不準確或假陰性結(jié)果。固定和包埋方法的不同或是組織內(nèi)部的不規(guī)則也可能造成異常的染色結(jié)果。同時，過度或不充分的復(fù)染也可能影響結(jié)果的正確解釋。

4） 對免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進行。任何染色或其缺失的解釋都應(yīng)以形態(tài)學(xué)、正確的對照以及其他試驗作為補充。

5） 試劑可能在未經(jīng)測試的組織中出現(xiàn)非預(yù)期的反應(yīng)。由于腫瘤或其他病態(tài)組織中的抗原表達具有生物變異性，因此無法完全消除被測組織出現(xiàn)非預(yù)期反應(yīng)的可能性。

6） 假陽性的結(jié)果可能會由于蛋白或底物反應(yīng)產(chǎn)物的非免疫學(xué)結(jié)合造成的。它們也可能會由紅血球和細胞色素 C 造成的。

【注意事項】

1） 本產(chǎn)品僅用于研究，不做其它用途。

2） 本產(chǎn)品需由專業(yè)人員使用。

3） 本產(chǎn)品含有生物來源材料，對其進行處理應(yīng)符合相關(guān)要求。

4） 應(yīng)用適當?shù)姆雷o措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

5） 本產(chǎn)品是否適用于非福爾馬林固定組織還未得到證實。

6） 本產(chǎn)品含有疊氮鈉作為防腐劑，疊氮鈉可以和鉛銅反應(yīng)而形成易爆炸的金屬疊氮化合物。為防止金屬疊氮化合物的形成，應(yīng)用大量的水沖洗以免其堆積。

【參考文獻】

1.Wright CL, et al., Am J Surg Pathol. 2003; 27:1393-1406.

2.Brueckl WM, et al., Anticancer Research 2003; 23: 1773-1778.

3.Renkonen E, et al., J Clin Oncol 2003; 21:3629-3637.

【生產(chǎn)企業(yè)】

廣州勉易生物科技有限公司

Myabtech Biological Inc.