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C4d說明書

說明書編號：MyR1-C4d253

（本抗體僅供研究使用，不用于臨床診斷）

【產品名稱】

【產品編號及包裝規(guī)格】

【預期用途】

本抗體試劑適用于福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織切片的免疫組織化學染色，用于標識C4d蛋白在組織中的表達。

C4d是經典補體激活的穩(wěn)定分裂產物，可用于檢測慢性腎移植排斥反應以及超急性排斥反應、急性血管性排斥反應、急性細胞排斥反應和邊緣排異反應。在這些排斥反應中，C4d沉積在腎小管周圍毛細血管。C4d檢測可作為腎移植存活率和治療急性排斥反應的重要指標。

（注：對免疫組化染色結果的解讀應結合病理形態(tài)學及其它資料進行，本染色結果不作為診斷指標。）

【主要組成成分】

單克隆兔抗人C4d蛋白抗體，克隆號：MyR1-C4d，免疫球蛋白分型：IgG。本產品為組織培養(yǎng)上清，含有0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.015 mol/L疊氮鈉（N_aN₃）及蛋白穩(wěn)定劑。

【儲存條件及有效期】

試劑需在2-8℃(不可低于0℃)避光保存。每次使用后應立即放回2-8℃冰箱保存。有效期見產品外包裝（注：如果試劑未按上述條件儲存, 可能影響其使用效果）。

【免疫組化染色原理】

在免疫學中，抗原抗體分子由于結構的互補和彼此親和性會發(fā)生特異性結合，基于此原理，抗體將會與待測人體組織及細胞中特異的抗原/蛋白結合。隨后通過氧化還原化學反應使標記抗體的酶顯色劑顯色，從而顯示組織及細胞內的抗原分布。

首先，本抗體與待測組織上的抗原特異性結合；其次，酶標抗小鼠/兔IgG聚合物識別已經連接上抗原的抗體；再次，加入顯色底物，聚合物上的辣根過氧化物酶可以催化DAB顯色液中的H₂O₂分解，使聯苯胺氧化變成聯苯亞胺，從而使組織切片中抗原位點處出現黃色或棕黃色著色；最后對樣本進行復染和封片。通過顯微鏡觀測顯色情況，推斷組織切片上該抗原的存在位置和表達情況。

【樣本要求】

新鮮活檢或手術樣本組織，經10%中性福爾馬林溶液固定6-24小時，按技術規(guī)范要求進行取材、脫水、石蠟包埋制成蠟塊。蠟塊在常溫條件下保存有效期5年。

對標本蠟塊進行切片，厚度3-5μm，粘附在經防脫處理的載玻片上，在58-60℃恒溫箱中烤片1小時，以備染色。暫不使用的白片在室溫（15-25℃）下保存（最好防氧化處理），為了良好地重現組織切片中的抗原分布情況，建議在7日內完成免疫組化染色。

【染色方法】

以下為針對手工免疫組化法推薦的配置及步驟，如果采用自動化免疫組化儀器進行染色，請根據不同的儀器及顯色試劑盒進行調整。一次完整的免疫組化實驗應設立陽性組織對照、陰性組織對照以及空白(或陰性)試劑對照，對實驗結果的評估及驗證請參照【質量控制】和【染色結果的解釋】。

1） 所需儀器、設備：

電磁爐、不銹鋼鍋、計時器、孵育濕盒、染色架、染色缸、蓋玻片、光學顯微鏡（40×-200×）、洗瓶、抽紙、移液器等。

2） 試劑、材料準備：

本抗體試劑工作液使用前無需稀釋,如為濃縮液，使用前推薦用PBS緩沖液或抗體稀釋液按1:100-1:200稀釋成工作液。PBS緩沖液、抗原修復液、二抗以及DAB顯色液等試劑的配制請參見各產品說明書。

實驗所需的其他材料如下所示：

PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、Tris-EDTA抗原修復液（pH9.0）、內源性過氧化物酶阻斷劑、HRP酶標記的抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色液、蘇木素染色液、空白(或陰性)對照試劑、陽性及陰性對照組織切片、二甲苯或二甲苯替代品、乙醇（無水、 95%、 85%）、蒸餾水或去離子水、封片劑（如中性樹膠）、防脫載玻片、蓋玻片等。

3） 實驗溫度條件：室溫18℃-28℃。

4） 實驗步驟：

A、脫蠟和水化

（1）將組織切片依次置于2缸新鮮二甲苯中，各浸泡10分鐘；

（2）將組織切片依次置于無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中，各浸泡5分鐘；

（3）蒸餾水輕柔沖洗1分鐘，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備修復。

B、抗原修復（高壓修復）

（1）取配制好的Tris-EDTA抗原修復液（pH9.0）于高壓鍋中，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入修復液中，確保組織切片完全浸入修復液；

（2）蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，大火（1600W/210℃）加熱至噴氣，從噴氣開始計時2分鐘并調至中火（800W/130℃），計時結束后，關閉電磁爐，將高壓鍋平穩(wěn)移離熱源，自然冷卻5分鐘；

（3）將高壓鍋平穩(wěn)轉移至水槽中，打開流水澆至鍋蓋，使鍋蓋降溫，直至自動鎖芯落到原位，關閉流水，取下限壓閥，小心打開鍋蓋（注意蒸汽燙傷），再向鍋內緩慢注入流水（避免流水直接沖向組織切片）；

（4）待溫度降至40℃以下時（水溫不燙手），取出切片架并快速浸入蒸餾水中（避免干片），用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備阻斷。

（注：修復后組織切片易干片，后續(xù)操作中“甩去組織切片多余液體”皆需注意不能讓組織干片，否則會影響染色效果。）

C、阻斷內源性過氧化物酶

（1）甩去組織切片多余液體，將玻片快速置于過氧化物酶阻斷劑（3% H₂O₂）中浸泡10分鐘；

（2）阻斷結束，用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準備畫圈。

D、畫圈

甩去或小心拭去組織切片周圍多余液體，用免疫組化油筆圍繞組織畫圈，畫圈位置應距組織邊緣2~3mm處，確保整個圈包圍全部組織后用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗掉多余油液后浸泡在PBS緩沖液中準備一抗孵育。

E、滴加一抗或對照試劑

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫的圈完全顯現后滴加一抗工作液使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育30分鐘；

（2）一抗孵育結束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

（注：實驗過程中，使用PBS緩沖液沖洗組織切片時，勿直接沖洗組織表面，否則可能導致掉片。）

F、滴加HRP酶標記的二抗聚合物

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫的圈完全顯現后滴加一步法二抗試劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育20分鐘；

（2）二抗孵育結束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

G、滴加DAB顯色劑

（1）甩去組織切片多余液體，滴加新鮮配制的DAB顯色劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育5分鐘；

（2）DAB孵育結束，將玻片上的DAB 震落于紙巾上，再放入蒸餾水中充分沖洗3分鐘×2次，終止染色。

H、復染、返藍

（1）蒸餾水充分沖洗后，置于蘇木素染色液中復染8~10秒，復染后用蒸餾水沖洗干凈；

（2）復染后，置于1%碳酸鋰溶液中返藍8~15秒，返藍后用蒸餾水沖洗干凈。

（注：依據不同蘇木素染色液的強度調整復染時間，以細胞核呈現淡藍到深藍顏色為宜，過染或不足染色都有可能影響結果的判斷。）

I、脫水、透明、封片

（1）甩去組織切片多余液體，將組織切片依次置于85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中，各浸泡3分鐘；

（2）脫水結束，將組織切片置于新鮮二甲苯中，浸泡5~10分鐘；

（3）待組織切片呈透亮狀態(tài)后即可使用中性樹膠和蓋玻片封片。

5） 結果判讀：

免疫組化染色結果要由有經驗的專業(yè)人員在光學顯微鏡下對染色后的切片進行觀察并進行判讀。

【質量控制】

在開始解讀待檢標本的染色結果前，應該先對試劑對照及組織對照等一系列質控的染色結果進行分析確認，與已知的陽性和陰性結果對比，并參考既往質控的染色結果。只有一系列對照都顯示了與已知相符的染色結果，待檢標本的染色結果才被認為是有效的。一次完整的免疫組化實驗應設立陽性組織對照、陰性組織對照以及空白(或陰性)試劑對照，以確保整個實驗過程是準確可控的。

陽性組織對照應該是新鮮的活檢或手術標本，按照與待檢標本相同的方法進行固定、前處理及石蠟包埋制片的。理想的陽性組織對照應該已知含有被測抗原高表達及低表達二種情況，以確保實驗結果能體現出不同待檢標本中的不同抗原表達水平，尤其可避免漏檢低表達的病例。正常的陽性組織對照染色結果表明待檢標本組織制備正確，染色方法適當。每次染色實驗均需要設立陽性組織對照。如果陽性組織對照未能顯示正確的陽性染色，則該次待檢標本的染色結果應該被認為是無效的。（注：陽性組織對照染色結果正常僅能表明實驗流程及試劑的性能符合要求，并不能作為待檢標本染色結果特異性的評價標準。）

陰性組織對照也應是按照與待檢標本相同的方法進行固定、前處理及石蠟包埋制片的，并且已知其中沒有被測抗原的表達。每次染色實驗均需要設立陰性組織對照，以確認抗體的性能，并能夠提供特異性染色的背景。大多數時候待檢標本組織切片內會含有不同的細胞類型，那些陰性的細胞可作為內部的陰性組織對照。如果陰性組織對照出現了特異性陽性染色，則該次待檢標本的染色結果應該被認為是無效的。

空白(或陰性)試劑對照可選擇用PBS緩沖液或與一抗同源的IgG替代一抗進行實驗，目的是評估一抗的特異性染色，判斷是否存在非特異性著色，并對抗原部位特異性染色提供更好的解釋?？瞻?或陰性)對照試劑的孵育時間和溫度應與一抗一致。

【染色結果的解釋】

免疫組化染色結果要由有經驗的專業(yè)人員在光學顯微鏡下對染色后的切片進行觀察并進行判讀。

A、 免疫組化染色結果應該建立在一系列對照染色結果都正常的基礎上，否則該次染色結果應該被認為是無效的。

B、 染色結果陽性（+）：在一系列對照染色結果都正常的基礎上，受檢組織切片中特定細胞的特定部位見有棕黃色著色，且無背景染色，表示被測抗原存在表達。

C、 染色結果陰性（-）：在一系列對照染色結果都正常的基礎上，受檢組織切片中特定細胞中未見棕黃色著色，表示被測抗原無表達或表達量極低。

【染色方法的局限性】

1） 標本的固定和前處理、組織的抗原修復、抗體孵育溫度及時間或其他實驗條件的改變都有可能影響染色結果的正確性。

2） 在每一次染色過程中，應該設立空白(或陰性)試劑對照、陽性組織對照及陰性組織對照，且所有對照染色結果都應正常，否則該次實驗被認為是無效的。

3） 完整的免疫組化實驗過程有多個步驟，包括試劑的選擇，組織的選擇，固定和處理，切片的準備，染色及結果解釋。染色前組織的處理方式能直接影響染色效果。不恰當的固定、冰凍、熔化、清洗、烘干、切片或被其他組織或液體污染都可能造成假陽性，抗體定位不準確或假陰性結果。固定和包埋方法的不同或是組織內部的不規(guī)則也可能造成異常的染色結果。同時，過度或不充分的復染也可能影響結果的正確解釋。

4） 對免疫組化染色結果的解讀應結合病理形態(tài)學及其它資料進行。任何染色或其缺失的解釋都應以形態(tài)學、正確的對照以及其他試驗作為補充。

5） 試劑可能在未經測試的組織中出現非預期的反應。由于腫瘤或其他病態(tài)組織中的抗原表達具有生物變異性，因此無法完全消除被測組織出現非預期反應的可能性。

6） 假陽性的結果可能會由于蛋白或底物反應產物的非免疫學結合造成的。它們也可能會由紅血球和細胞色素 C 造成的。

【注意事項】

1） 本產品僅用于研究，不做其它用途。

2） 本產品需由專業(yè)人員使用。

3） 本產品含有生物來源材料，對其進行處理應符合相關要求。

4） 應用適當的防護措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

5） 本產品是否適用于非福爾馬林固定組織還未得到證實。

6） 本產品含有疊氮鈉作為防腐劑，疊氮鈉可以和鉛銅反應而形成易爆炸的金屬疊氮化合物。為防止金屬疊氮化合物的形成，應用大量的水沖洗以免其堆積。

【參考文獻】

[1] Jianghua C1, Wenqing X, Huiping W., et al. C4d as a significant predictor for humoral rejection in renal allografts. Clin Transplant. 2005 Dec;19(6):785-91.

[2] Kayler LK1, Kiss L, Sharma V et al.. Acute renal allograft rejection: diagnostic significance of focal peritubular capillary C4d. Transplantation. 2008 Mar 27;85(6):813-20.

【生產企業(yè)】

廣州勉易生物科技有限公司

Myabtech Biological Inc.