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Histone H3 K36M說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)編號(hào)：MyR1-H3K36M253

（本抗體僅供研究使用，不用于臨床診斷）

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

【產(chǎn)品編號(hào)及包裝規(guī)格】

【預(yù)期用途】

本抗體試劑適用于福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織切片的免疫組織化學(xué)染色，用于標(biāo)識(shí)Histone H3 K36M蛋白在組織中的表達(dá)。

軟骨母細(xì)胞瘤由密集排列的軟骨母細(xì)胞、多少不一的破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞以及鈣化的軟骨樣基質(zhì)構(gòu)成。H3F3A和H3F3B是兩個(gè)編碼組蛋白H3.3變異型的基因。在95%的軟骨母細(xì)胞瘤中存在H3F3A和H3F3B中的賴氨酸36到甲硫氨酸（K36M）突變，突變主要位于H3F3B。研究顯示，免疫組織化學(xué)H3.3K36M突變蛋白檢測(cè)在軟骨母細(xì)胞瘤中顯示較高的特異度和靈敏度，靈敏度為95.6%，特異度為100%，在臨床實(shí)踐中具有較高的價(jià)值。

（注：對(duì)免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進(jìn)行，本染色結(jié)果不作為診斷指標(biāo)。）

【主要組成成分】

單克隆兔抗人Histone H3 K36M蛋白抗體，克隆號(hào)：MyR1-H3K36M，免疫球蛋白分型：IgG。本產(chǎn)品為組織培養(yǎng)上清，含有0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.015 mol/L疊氮鈉（N_aN₃）及蛋白穩(wěn)定劑。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑需在2-8℃(不可低于0℃)避光保存。每次使用后應(yīng)立即放回2-8℃冰箱保存。有效期見(jiàn)產(chǎn)品外包裝（注：如果試劑未按上述條件儲(chǔ)存, 可能影響其使用效果）。

【免疫組化染色原理】

在免疫學(xué)中，抗原抗體分子由于結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)和彼此親和性會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，基于此原理，抗體將會(huì)與待測(cè)人體組織及細(xì)胞中特異的抗原/蛋白結(jié)合。隨后通過(guò)氧化還原化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的酶顯色劑顯色，從而顯示組織及細(xì)胞內(nèi)的抗原分布。

首先，本抗體與待測(cè)組織上的抗原特異性結(jié)合；其次，酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物識(shí)別已經(jīng)連接上抗原的抗體；再次，加入顯色底物，聚合物上的辣根過(guò)氧化物酶可以催化DAB顯色液中的H₂O₂分解，使聯(lián)苯胺氧化變成聯(lián)苯亞胺，從而使組織切片中抗原位點(diǎn)處出現(xiàn)黃色或棕黃色著色；最后對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染和封片。通過(guò)顯微鏡觀測(cè)顯色情況，推斷組織切片上該抗原的存在位置和表達(dá)情況。

【樣本要求】

新鮮活檢或手術(shù)樣本組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定6-24小時(shí)，按技術(shù)規(guī)范要求進(jìn)行取材、脫水、石蠟包埋制成蠟塊。蠟塊在常溫條件下保存有效期5年。

對(duì)標(biāo)本蠟塊進(jìn)行切片，厚度3-5μm，粘附在經(jīng)防脫處理的載玻片上，在58-60℃恒溫箱中烤片1小時(shí)，以備染色。暫不使用的白片在室溫（15-25℃）下保存（最好防氧化處理），為了良好地重現(xiàn)組織切片中的抗原分布情況，建議在7日內(nèi)完成免疫組化染色。

【染色方法】

以下為針對(duì)手工免疫組化法推薦的配置及步驟，如果采用自動(dòng)化免疫組化儀器進(jìn)行染色，請(qǐng)根據(jù)不同的儀器及顯色試劑盒進(jìn)行調(diào)整。一次完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照以及空白(或陰性)試劑對(duì)照，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估及驗(yàn)證請(qǐng)參照【質(zhì)量控制】和【染色結(jié)果的解釋】。

1） 所需儀器、設(shè)備：

電磁爐、不銹鋼鍋、計(jì)時(shí)器、孵育濕盒、染色架、染色缸、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡（40×-200×）、洗瓶、抽紙、移液器等。

2） 試劑、材料準(zhǔn)備：

本抗體試劑工作液使用前無(wú)需稀釋,如為濃縮液，使用前推薦用PBS緩沖液或抗體稀釋液按1:100-1:200稀釋成工作液。PBS緩沖液、抗原修復(fù)液、二抗以及DAB顯色液等試劑的配制請(qǐng)參見(jiàn)各產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

實(shí)驗(yàn)所需的其他材料如下所示：

PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、HRP酶標(biāo)記的抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色液、蘇木素染色液、空白(或陰性)對(duì)照試劑、陽(yáng)性及陰性對(duì)照組織切片、二甲苯或二甲苯替代品、乙醇（無(wú)水、 95%、 85%）、蒸餾水或去離子水、封片劑（如中性樹(shù)膠）、防脫載玻片、蓋玻片等。

3） 實(shí)驗(yàn)溫度條件：室溫18℃-28℃。

4） 實(shí)驗(yàn)步驟：

A、脫蠟和水化

（1）將組織切片依次置于2缸新鮮二甲苯中，各浸泡10分鐘；

（2）將組織切片依次置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中，各浸泡5分鐘；

（3）蒸餾水輕柔沖洗1分鐘，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備修復(fù)。

B、抗原修復(fù)（高壓修復(fù)）

（1）取配制好的Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）于高壓鍋中，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入修復(fù)液中，確保組織切片完全浸入修復(fù)液；

（2）蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，大火（1600W/210℃）加熱至噴氣，從噴氣開(kāi)始計(jì)時(shí)2分鐘并調(diào)至中火（800W/130℃），計(jì)時(shí)結(jié)束后，關(guān)閉電磁爐，將高壓鍋平穩(wěn)移離熱源，自然冷卻5分鐘；

（3）將高壓鍋平穩(wěn)轉(zhuǎn)移至水槽中，打開(kāi)流水澆至鍋蓋，使鍋蓋降溫，直至自動(dòng)鎖芯落到原位，關(guān)閉流水，取下限壓閥，小心打開(kāi)鍋蓋（注意蒸汽燙傷），再向鍋內(nèi)緩慢注入流水（避免流水直接沖向組織切片）；

（4）待溫度降至40℃以下時(shí)（水溫不燙手），取出切片架并快速浸入蒸餾水中（避免干片），用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備阻斷。

（注：修復(fù)后組織切片易干片，后續(xù)操作中“甩去組織切片多余液體”皆需注意不能讓組織干片，否則會(huì)影響染色效果。）

C、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

（1）甩去組織切片多余液體，將玻片快速置于過(guò)氧化物酶阻斷劑（3% H₂O₂）中浸泡10分鐘；

（2）阻斷結(jié)束，用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備畫(huà)圈。

D、畫(huà)圈

甩去或小心拭去組織切片周?chē)嘤嘁后w，用免疫組化油筆圍繞組織畫(huà)圈，畫(huà)圈位置應(yīng)距組織邊緣2~3mm處，確保整個(gè)圈包圍全部組織后用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗掉多余油液后浸泡在PBS緩沖液中準(zhǔn)備一抗孵育。

E、滴加一抗或?qū)φ赵噭?/span>

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫(huà)的圈完全顯現(xiàn)后滴加一抗工作液使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育30分鐘；

（2）一抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

（注：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用PBS緩沖液沖洗組織切片時(shí)，勿直接沖洗組織表面，否則可能導(dǎo)致掉片。）

F、滴加HRP酶標(biāo)記的二抗聚合物

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫(huà)的圈完全顯現(xiàn)后滴加一步法二抗試劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育20分鐘；

（2）二抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

G、滴加DAB顯色劑

（1）甩去組織切片多余液體，滴加新鮮配制的DAB顯色劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育5分鐘；

（2）DAB孵育結(jié)束，將玻片上的DAB 震落于紙巾上，再放入蒸餾水中充分沖洗3分鐘×2次，終止染色。

H、復(fù)染、返藍(lán)

（1）蒸餾水充分沖洗后，置于蘇木素染色液中復(fù)染8~10秒，復(fù)染后用蒸餾水沖洗干凈；

（2）復(fù)染后，置于1%碳酸鋰溶液中返藍(lán)8~15秒，返藍(lán)后用蒸餾水沖洗干凈。

（注：依據(jù)不同蘇木素染色液的強(qiáng)度調(diào)整復(fù)染時(shí)間，以細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)到深藍(lán)顏色為宜，過(guò)染或不足染色都有可能影響結(jié)果的判斷。）

I、脫水、透明、封片

（1）甩去組織切片多余液體，將組織切片依次置于85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇中，各浸泡3分鐘；

（2）脫水結(jié)束，將組織切片置于新鮮二甲苯中，浸泡5~10分鐘；

（3）待組織切片呈透亮狀態(tài)后即可使用中性樹(shù)膠和蓋玻片封片。

5） 結(jié)果判讀：

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后的切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判讀。

【質(zhì)量控制】

在開(kāi)始解讀待檢標(biāo)本的染色結(jié)果前，應(yīng)該先對(duì)試劑對(duì)照及組織對(duì)照等一系列質(zhì)控的染色結(jié)果進(jìn)行分析確認(rèn)，與已知的陽(yáng)性和陰性結(jié)果對(duì)比，并參考既往質(zhì)控的染色結(jié)果。只有一系列對(duì)照都顯示了與已知相符的染色結(jié)果，待檢標(biāo)本的染色結(jié)果才被認(rèn)為是有效的。一次完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照以及空白(或陰性)試劑對(duì)照，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是準(zhǔn)確可控的。

陽(yáng)性組織對(duì)照應(yīng)該是新鮮的活檢或手術(shù)標(biāo)本，按照與待檢標(biāo)本相同的方法進(jìn)行固定、前處理及石蠟包埋制片的。理想的陽(yáng)性組織對(duì)照應(yīng)該已知含有被測(cè)抗原高表達(dá)及低表達(dá)二種情況，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果能體現(xiàn)出不同待檢標(biāo)本中的不同抗原表達(dá)水平，尤其可避免漏檢低表達(dá)的病例。正常的陽(yáng)性組織對(duì)照染色結(jié)果表明待檢標(biāo)本組織制備正確，染色方法適當(dāng)。每次染色實(shí)驗(yàn)均需要設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照。如果陽(yáng)性組織對(duì)照未能顯示正確的陽(yáng)性染色，則該次待檢標(biāo)本的染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。（注：陽(yáng)性組織對(duì)照染色結(jié)果正常僅能表明實(shí)驗(yàn)流程及試劑的性能符合要求，并不能作為待檢標(biāo)本染色結(jié)果特異性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。）

陰性組織對(duì)照也應(yīng)是按照與待檢標(biāo)本相同的方法進(jìn)行固定、前處理及石蠟包埋制片的，并且已知其中沒(méi)有被測(cè)抗原的表達(dá)。每次染色實(shí)驗(yàn)均需要設(shè)立陰性組織對(duì)照，以確認(rèn)抗體的性能，并能夠提供特異性染色的背景。大多數(shù)時(shí)候待檢標(biāo)本組織切片內(nèi)會(huì)含有不同的細(xì)胞類(lèi)型，那些陰性的細(xì)胞可作為內(nèi)部的陰性組織對(duì)照。如果陰性組織對(duì)照出現(xiàn)了特異性陽(yáng)性染色，則該次待檢標(biāo)本的染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。

空白(或陰性)試劑對(duì)照可選擇用PBS緩沖液或與一抗同源的IgG替代一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，目的是評(píng)估一抗的特異性染色，判斷是否存在非特異性著色，并對(duì)抗原部位特異性染色提供更好的解釋?？瞻?或陰性)對(duì)照試劑的孵育時(shí)間和溫度應(yīng)與一抗一致。

【染色結(jié)果的解釋】

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后的切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判讀。

A、 免疫組化染色結(jié)果應(yīng)該建立在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，否則該次染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。

B、 染色結(jié)果陽(yáng)性（+）：在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細(xì)胞的特定部位見(jiàn)有棕黃色著色，且無(wú)背景染色，表示被測(cè)抗原存在表達(dá)。

C、 染色結(jié)果陰性（-）：在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細(xì)胞中未見(jiàn)棕黃色著色，表示被測(cè)抗原無(wú)表達(dá)或表達(dá)量極低。

【染色方法的局限性】

1） 標(biāo)本的固定和前處理、組織的抗原修復(fù)、抗體孵育溫度及時(shí)間或其他實(shí)驗(yàn)條件的改變都有可能影響染色結(jié)果的正確性。

2） 在每一次染色過(guò)程中，應(yīng)該設(shè)立空白(或陰性)試劑對(duì)照、陽(yáng)性組織對(duì)照及陰性組織對(duì)照，且所有對(duì)照染色結(jié)果都應(yīng)正常，否則該次實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是無(wú)效的。

3） 完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程有多個(gè)步驟，包括試劑的選擇，組織的選擇，固定和處理，切片的準(zhǔn)備，染色及結(jié)果解釋。染色前組織的處理方式能直接影響染色效果。不恰當(dāng)?shù)墓潭?、冰凍、熔化、清洗、烘干、切片或被其他組織或液體污染都可能造成假陽(yáng)性，抗體定位不準(zhǔn)確或假陰性結(jié)果。固定和包埋方法的不同或是組織內(nèi)部的不規(guī)則也可能造成異常的染色結(jié)果。同時(shí)，過(guò)度或不充分的復(fù)染也可能影響結(jié)果的正確解釋。

4） 對(duì)免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進(jìn)行。任何染色或其缺失的解釋都應(yīng)以形態(tài)學(xué)、正確的對(duì)照以及其他試驗(yàn)作為補(bǔ)充。

5） 試劑可能在未經(jīng)測(cè)試的組織中出現(xiàn)非預(yù)期的反應(yīng)。由于腫瘤或其他病態(tài)組織中的抗原表達(dá)具有生物變異性，因此無(wú)法完全消除被測(cè)組織出現(xiàn)非預(yù)期反應(yīng)的可能性。

6） 假陽(yáng)性的結(jié)果可能會(huì)由于蛋白或底物反應(yīng)產(chǎn)物的非免疫學(xué)結(jié)合造成的。它們也可能會(huì)由紅血球和細(xì)胞色素 C 造成的。

【注意事項(xiàng)】

1） 本產(chǎn)品僅用于研究，不做其它用途。

2） 本產(chǎn)品需由專(zhuān)業(yè)人員使用。

3） 本產(chǎn)品含有生物來(lái)源材料，對(duì)其進(jìn)行處理應(yīng)符合相關(guān)要求。

4） 應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

5） 本產(chǎn)品是否適用于非福爾馬林固定組織還未得到證實(shí)。

6） 本產(chǎn)品含有疊氮鈉作為防腐劑，疊氮鈉可以和鉛銅反應(yīng)而形成易爆炸的金屬疊氮化合物。為防止金屬疊氮化合物的形成，應(yīng)用大量的水沖洗以免其堆積。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Amary M F ,  F  Berisha,  Mozela R , et al. The H3F3 K36M mutant antibody is a sensitive and specific marker for the diagnosis of chondroblastoma[J]. Histopathology, 2016.

[2]宮麗華, 張文, 董榮芳,等. H3.3 K36M突變蛋白表達(dá)在軟骨母細(xì)胞瘤診斷及鑒別診斷中的價(jià)值[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2021, 50(03):242-244.

【生產(chǎn)企業(yè)】

廣州勉易生物科技有限公司

Myabtech Biological Inc.